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男性染色体可以控制性别,透析XY精子分离术技术

  近几十年来人们对动物的性别控制进行了大量的研究,如与Y精子的分离、鉴定胚胎性别、应用性激素、改变体液酸碱度、食物营养、饲喂不同金属元素、改变生殖道环境、杀死或灭活带某种染色体的精子等。其中,在哺乳动物中主要应用X与Y精子的分离和鉴定胚胎性别的方法。

  多年来,人们对X、Y精子之间的某些差异进行了大量研究,并力图利用这些差异来分离不同染色体的精子。

  X与Y精子的差别

  Y精子的F小体

  1968年 Cosperson在研究男性染色体时发现,在Y染色体长臂末端发出有比其他部分强的荧光亮点,并将这些点称为F小体。1970年 Barlow等在Y精子头部发现F小体,且F小体在人和家畜的精子上都能见到。后来经实验反复证明,有F小体的精子一定是Y精子,而没有的则是X精子。

  精子的重量

  X与Y精子在重量和比重上有差异,主要表现在DNA量的不同。X与Y精子染色体所含DNA不同,X染色体的DNA含量比Y染色体多,重量和体积也大。两者的DNA含量差异一般在3%~5%之间,如牛为3.9%、绒鼠为7.5%。由于重量和比重的不同,而致X和Y精子在液体中运动力、沉降速度等的不同。

  精子运动

  Y精子的活动能力比X精子强,运动速度快,在含血清蛋白的稀释液中呈直线运动。Y精子尾部膜电荷较多,而X精子头部膜电荷较多。

  精子的耐酸碱性

  Y精子嗜碱性,而X精子则嗜酸性。

  精子表面的H-Y抗原及分布

  H-Y抗原即雄性特异性次要组织相容性抗原( male specific minor histocompatibility-Y antigen),是一种弱抗原,只有Y精子才能表达H-Y抗原。其分布也依精子的来源不同而有差异,附睾头分离的精子H-Y抗原主要分布于靠近精子的尾部,附睾尾分离的精子H-Y抗原主要分布在顶体后端。

  尽管对X、Y精子的差异已经进行了大量的工作,但是除了X、Y精子的DNA含量具有明显的差异外,其他方面的差异表现甚微,还经常由于各种环境条件的不同而产生变化,需要继续深入开展研究,为发展新的精子分离技术提供理论基础。

  XY精子分离方法

  沉降法

  根据X、Y精子在体积和重量上的差别,利用具有一定黏稠度的分离液对精子进行沉淀分离,上层主要为Y精子,下层主要为X精子。沉降法虽然有一定的效果,但试验结果不稳定。

  离心沉降法

  由于X精子的DNA含量高于Y精子,导致X精子的密度及重量大于Y精子,在离心时X精子的沉降速度快于Y精子,下层液体中X精子的含量可大大提高。此方法的优点是分离时间比般沉淀分离短得多,并对精子的活力影响较小。但是X精子间沉降速度的差异有时会比X与Y精子间的差异还大,因此,分离结果很不稳定。

男性染色体可以控制性别,透析XY精子分离术技术

  电泳法

  依据X、Y精子表面膜电荷的不同,通过电泳时X、Y精子在电场中向不同电极移动而达到分离的目的。 Mobri等(1986)用自由电泳法处理人的精液时发现,在ph7.4时,阳极侧多为X精子,阴极侧多为Y精子(80%)。 Engelmannl等(1988)用此方法却得到与此完全相反的结果。在许多研究报告中,采用多种形式的电泳分离但其结论不一致,分离结果也不稳定。该方法还有待进一步研究和改进。

  免疫学分离法

  该方法是利用H-Y抗体检测精子质膜上存在的H-Y抗原,以此来分离X精子和Y精子。由于H-Y抗原极弱,对细胞表面H-Y抗原进行血清学和免疫学的检测效果最初并不理想。随着生产高效价H-Y抗体方法的发展,应用H-Y抗体兔疫学亲和柱层析才成功地分离了人和小鼠的H-Y阳性和阴性精子,利用H-Y抗原进行动物性别的控制的研究取得了实质性进展。 Bryant将人和小鼠精液采用H-Y抗血清免疫过滤亲和柱进行精子分离,富集到的人Y精子80%~90%为阳性,富集的小鼠Y精子80%为阳性,富集后的X精子70%为阴性。Zavos将富集后的兔精子受精后雌性为78.19%,牛的精子受精后雌性达74.14%,将6头公牛精液处理后给50头超排母牛受精,结果在195个胚胎中有103个为雌性,占81.11%,对分离后的精液给492头母牛受精后,在187头活犊中,雌性占65.12%,罗承浩等采用H-Y抗血清IgG作用乳牛精液,受精后获81.18%的雌性犊牛。Jones等采用一种免疫磁力方法,其X精子纯度达到98%,从上述结果看,采用H-Y抗原的免疫方法分离X、Y精子是一种较有前景的分离方法,可获得高纯度的X、Y精子群,但该方法存在着对Y精子的损伤问题。

  流式细胞分离法

  流式细胞分离法是根据X、Y精子上DNA含量的微小差别,通过流式细胞仪(folw cytometer)进行分离,并可同时测定X、Y精子DNA含量的微小差异,进行分离时,首先将精子稀释并与荧光染料 Hoechst33342共同培养,这种染料可以定量地与DNA结合,精子通过检测仪时被激光束激发,由于X精子比Y精子含较多的DNA,X精子放射出较强的荧光信号,放射出的信号通过仪器和计算机系统扩增,分析并分辨X精子Y精子。当含有精子的缓冲液离开激光系统时,借助于颤动的流动室将垂直流下的液柱变成微小的液滴。与此同时,含有单个精子的液滴被充上正电荷或负电荷,并借助两块各自带正电或负电的偏斜板,把X或Y精子分别引导到2个收管中。

  流式细胞分离法开创了精子分离的新局面,Johson等用该方法分离的兔Y精子输精后,预测雄性兔比例为81%,实际得到的比例也是81%;X精子输精后预测雄兔的比例为14%,实际产雄兔的比例为6%。Abeydeera等利用该法分离的猪X精子授精,产雌性23头,雄性1头,准确率为97%;利用分离的Y精子投精,产雄性仔猪率高达100%。目前对活的精子分离时,由于核的朝向不一致,加之尾部的影,而不能充分地对所有精子准确地进行区别和分离。另外,还存在分离速度慢和时间较长的问题,分离后的精子活率也受到一定影响,受胎率有所降低。但是,这是当前精子分离方法中最新的也是分离纯度较高的一种方法,如果结合显微注射技术,流式细胞分离法将成为有效的分离X、Y精子的技术而被广泛应用于胚胎工程的研究与实践。

  化学药品处理法

  该方法根据X、Y精子嗜酸碱性的不同,通过使用化学试剂预先处理阴道,改变生殖道的pH,从而达到选择性利用精子控制动物性别的目的。黑木常青在输精前20~30min注入某一浓度的精氨酸液1ml,结果注入高浓度和中浓度的牛产公犊的多,注入低浓度的产母犊的多。唐正飞用碱性饲料饲喂兔子并在交配前将碱性溶液注入阴道,所生仔兔中雄性比例达到64%~77%。从生产实用性看,如果能用控制生殖道的pH来控制性别,那将具有重要的意义。


参考资料

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